عفونت­های ناشی از قارچ‌ها

Real-Time PCRاستفاده از

برای تشخيص عفونت­های ناشی از قارچ‌های رشته­ ای

پيام بهزادي1، الهام بهزادي2، لرنيک عيساخانيان2

•1)     عضو هيأت علمی گروه ميکروب­شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس

•2)     گروه ميکروب­شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس

به­ طور کلی، قارچ­های رشته ­ای عالی که در بردارنده­ی ديواره­ی عرضی در هيف­های خود هستند در طبيعت انتشار وسيع داشته و در همه جا يافت می­شوند. برخی از آنها مانند Aspergillus spp. در افراد انسانی و به‌ويژه در بيماران مبتلا به نوتروپنی و نقص در سيستم ايمنی موجب عفونت­های قارچی مهاجم می­شوند. بررسی‌ها نشان می­دهند که ميزان مرگ و مير ناشی از عفونت­های قارچی حدود 92% می‌باشد، از اين­رو، تشخيص سريع ‌و قطعی عفونت­های ‌قارچی ‌مهاجم ‌که توسط قارچ‌های رشته­ای و يا اصطلاحاً کپک­ها ايجاد می­گردد، نقش تعيين‌کننده­ای را در نجات بيماران از مرگ بر عهده دارد. اما در اين ميان، مشکلاتی وجود دارد که مانع از تشخيص سريع و قطعی عوامل قارچی می­گردد؛ مانند عدم امکان استفاده از روش­های جراحی در بيمارانی که خونشان به­صورت طبيعی منعقد نمی­گردد (ترومبوسيتوپنی)، عدم شک به عفونت­های قارچی، بسياری از بيماری­های قارچی پس از نمونه­برداری از جسد بيمار شناسايي می­شوند، بدن بيماران مبتلا به نقص سيستم ايمنی، قادر به واکنش مناسب نبوده، از اين­رو نمی­توان به کمک آزمون­های سرم‌شناسی اقدام به شناسايي عوامل ميکروبی و از جمله قارچ­ها نمود، بسياری از قارچ­های رشته­ای و به­ويژه Aspergillus spp. برخلاف باکتری­ها، به‌ندرت از کشت خون جدا می­شوند. به­دليل انتشار گسترده­ی قارچ­های رشته­ای در هوا، در بسياری از موارد حتی از مجاری تنفسی افراد سالم نيز می­توان آنها را جدا نمود؛ بنابراين، به هنگام جداسازی قارچ­های رشته­ای از افراد، می­بايستی تظاهرات بالينی، تصاوير راديولوژی و نتايج کشت­های ميکروبی نيز در نظر گرفته شود.

با توجه به آنچه گفته شد، استفاده از روش­هايي که نياز به جراحی نداشته و در عين حال قابل اطمينان، حساس و اختصاصی باشند بهترين گزينه جهت شناسايي عفونت­های قارچی رشته­ای مهاجم به شمار می­آيد. به همين دليل، استفاده از واکنش زنجيره­ای پليمراز (PCR) گزينه­ی مناسبی برای بررسی نمونه­های بالينی و از جمله خون بوده که دارای حساسيت بالا است و امکان آلودگی نمونه نيز کمتر می­باشد ضمن اين­که سهولت و تکرارپذيری آزمايش، جلوه­ای ويژه به روش PCR داده است. امروزه، برای بالا بردن سطح درستی و سهولت آزمايش­ها از Real-Time PCR استفاده می­گردد. با توجه به مطالعات انجام شده مشخص شده اســـــــت که Real-Time PCR روشی حساس، اختصاصی و کمی است که برای شناسايي عفونت­های قارچی رشته­ای مهاجم در نمونه­های بالينی نظير سرم خون بسيار مناسب است.  همچنين،  به­دليــل پيوستگی در مراحل Real-Time PCR امکان آلودگی نمونه بسيار کاهش يافته است. اما، آنچه در روش­های مولکولی و از جمله Real-Time PCR از اهميت ويژه­ای برخوردار می­باشد آن است که می­بايستی از پرايمرهای کارآمد و درست استفاده نمود؛ معمولاً طراحی پرايمرها و کاوشگرها توسط پژوهشگران و شرکت­های سازنده­ی کيت­های تجاری‌آزمون­های زيست‌شناسی مولکولی انجام می­گيرد.  به‌دليل اهميت موضوع، در پايين به شرح آن پرداخته می­شود.

طراحی پرايمرها و کاوشگرها

بهتر است طراحی پرايمرها بر اساس توالی نوکلئوتيدی يک قارچ مشخص صورت گيرد و پس از ارزيابی و مقايسه‌چندين ژن، يک توالی مشخص مورد استفاده قرار گيرد. برای مثال، برای شناسايي گونه­های قارچ Aspergillus می­تــــــــوان با استناد به يکی از گونه­های شناخته شده­ی آن مانند Aspergillus fumigatus، ژنی مانند ژن RNA ريبوزومی 5.8S که دربردارنده­ی توالی­های حفظ شده در همه­ی گونه­های جنس مربوطه است را انتخاب نمود. برای مطالعه­ی نمونه‌های بالينی، بايستی توجه داشت که توالی­های مربوطه با مولکول­های DNA از مخمر و انسان يکنواختی و همخوانی نداشته باشد. استفاده از پيشنهادات کمپانی­ها برای طراحی توالی نوکلئوتيدی پرايمرها و طراحی نظری پرايمرها به کمک نرم‌افزارهای پرايمرسازی جهت تعيين حساسيت و اختصاصی بودن آنها توسط پژوهشگران و محققين به نتيجه­ی بهتر کار بسيار کمک می­نمايد. از پرايمرهای مناسب که در مقالات به چاپ رسيده‌می‌توان به
5'-TTGGTTCCGGCATCGA و 5'-GCAGCAATGACGCTCGG اشاره نمود که توالی 235 تا 376 از ژن به شماره ثبت AF138288 پايگاه داده­های GenBank گرفته شده و دارای 142 جفت باز است.

کاوشگر مربوطه 5'-6-FAM-TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA-TAMRA
بوده که FAM (6-carboxy-fluorescein) و TAMRA
(6-carboxy-N,N,N',N'-tetramethylrhodamine) هر دو از رنگ­های درخشان به ‌شمار می­آيند. مجموعه­ی توالی­های ياد شده در بالا، به­طور قابل توجهی با بسياری از گونه­های Fusarium و Scedosporium همخوانی داشته و می­توان برای شناسايي آنها استفاده نمود.

در پايان بايستی توجه داشت که طراحی پرايمرها و کاوشگرها نقش مستقيمی در نتيجه­ی کار داشته،  ضمن اين‌که فرآيندسازی مولکول­های DNA موردمطالعه، به همان ميزان دارای اهميت می­باشد.

منابع

•1)Pham, A.S., Tarrand, J.J., May, G.S., Lee, M.S., Kontoyiannis, D.P., Han, X.Y., Diagnosis of Invasive Mold Infection by Real-Time Quantitative PCR, Am J Clin Pathol 2003; 119:38-44

•2)Singleton, P., Sainsbury, D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, John Wiley and Sons, 3rd Edition, 2002


1393/02/20 12:00:00 ق.ظ
فایلهای مربوط به مقاله
نماپ
سماپ
مقالات
تماس با ما
طراحی و توسعه توسط گروه متخصصین ماورانت
www.Mavaranet.com