آنالیز اسپرم- 2

 

 بررسي‌هاي ميكروسكپي اوليه براي بررسي نمونه مايع مني بطور مستقيم (بدون رنگ‌آميزي)با استفاده از ميكروسكپ فازكنتراست توصيه مي‌شود.

 مخلوط كردن مايع مني و برداشتن نمونه از آن:

 در صورتي كه مايع مني به خوبي مخلوط نشود برداشتن دو نمونه از قسمت‌هاي مختلف آن باعث مي‌شود كه نتايج متفاوتي در ميزان حركت، زنده بودن، غلظت و حتي مورفولوژي اسپرم حاصل گردد. مخلوط نمودن نمونه نبايد آنقدر شديد باشد كه ايجاد حباب نمايد. براي اين‌كار از يك پي‌پت پلاستيكي يكبار مصرف استفاده نموده و آن را 10 بار در آن آسپيره مي‌نماييم. قطر داخلي اين پي‌پت بايد حدوداً 5/1 ميلي‌متر باشد.براي مخلوط كردن هرگز از ورتكس استفاده نكنيد زيرا باعث تخريب اسپرم‌ها مي‌گردد. در صورتي‌كه نمونه بخوبي مخلوط شده باشد نتايج حاصل از تكرار آزمايش هم‌خواني خواهند داشت. براي ارزيابي هم‌خواني نتايج از توزيع پواسون (poisson distribution) و توزيع دو جمله اي (binomial distribution) استفاده مي‌كنيم كه شرح آنها در بخش‌هاي آينده خواهد آمد.

ابتدا با بزرگنمايي 100 (مثلاً عدسي 10 شيئي و 10 چشمي) موارد زير را بررسي مي‌كنيم

-        وجود رشته‌هاي موكوس 

-        تجمع (aggregation) و بهم چسبيدن (agglutination) اسپرم‌ها

-       وجود سلول‌هاي غير اسپرم مثل سلول‌هاي اپي‌تليال و سلول‌هاي گرد(round cells) در نمونه،   

        سلول‌هاي گرد شامل گلبول‌هاي سفيد و سلول‌هاي زاياي نابالغ (immature germ cells) مي‌باشند.

 گاهي ممكن است سرهاي بدون دم و يا دم‌هاي بدون سر را نيز مشاهده نمود. سپس با استفاده از بزرگنمايي 200 يا 400 موارد زير را بررسي مي‌كنيم.

-         ارزيابي حركت اسپرم‌ها

-         مشاهده اسپرم‌ها و تعيين رقت مناسب براي شمارش صحيح آنها

 تهيه لام مستقيم: ابتدا نمونه را بخوبي مخلوط نموده و قبل از اين‌كه اسپرم‌ها ته‌نشين شوند مقداري از آن را براي آزمايش برمي‌داريم. حجم نمونه‌اي كه برداشته مي‌شود و لامل مورد استفاده بايد استاندارد باشد به نحوي‌كه فضاي زير لامل حدوداً 20 μm گردد. در اين فضا اسپرم‌ها آزادانه حركت خواهند كرد. براي اين كار حدود 10 μL از نمونه را روي يك لام تميز قرار داده و آن را با يك لامل 22×22 مي پوشانيم و سپس سريعاً بررسي مي نماييم.

هنگام گذاشتن لامل بايد دقت كرد تا حباب هوا در زير لامل تشكيل نشود.نحوه محاسبه فضاي زير لامل تقسيم حجم نمونه (V) بر سطحي كه نمونه در آن پخش مي‌شود (A) مي‌توان عمق نمونه را در زير لامل تعيين نمود.بدين‌ترتيب وقتي 10 μL از مايع مني را روي لام گذاشته و آن را با لامل 22×22 mm مي‌پوشانيم عمق حاصل حدود20μm خواهد بود. گاهي ممكن است نياز داشته باشيم كه عمق نمونه در زير لامل بيشتر باشد، براي اين‌كار  40 μm از نمونه را روي لام گذاشته و يك لامل50×24mm ‌ روي آن قرار مي‌دهيم. در اين حالت عمقي حدود3/33 μm  خواهيم داشت.

  توجه:

1-    اگر عمق نمونه در زير لامل كمتر از 20 μm باشد اسپرم‌ها دچار حركات چرخشي خواهند شد.

2-    اگر عمق نمونه خيلي زياد باشد اسپرم‌ها دائماً از فوكوس خارج شده و ارزيابي آنها مشكل خواهدبود.   

3-    در صورتي كه تعداد اسپرم‌ها در فيلدهاي مختلف تفاوت زيادي با هم داشته باشد نشانه آن است كه    نمونه يكنواخت نمي‌باشد و در اين‌صورت بايد آن را مجدداً مخلوط نموده و لام ديگري تهيه نماييم.

4-    يكنواخت نبودن نمونه ممكن است ناشي از قوام غيرطبيعي، عدم سياليت، چسبندگي يا تجمع اسپرم‌ها باشد.

تجمع اسپرم‌ها (aggregation)چسبيدن اسپرم‌هاي بي‌حركت به يكديگر و يا چسبيدن اسپرم‌هاي متحرك به الياف موكوس، سلول‌هاي غير اسپرم و يا ذرات ديگر را تجمع اسپرم (aggregation) مي‌‌گويند.

بهم چسبيدن اسپرم‌ها(agglutination)زماني است كه اسپرم‌هاي متحرك به يكديگر چسبيده باشند. اين چسبندگي ممكن است بين سرها، دم‌ها و يا مخلوطي از آنها باشد. اسپرم‌هاي بهم‌چسبيده داراي حركات شديد مي‌باشند، اما گاهي چسبندگي به شكلي است كه حركات اسپرم‌ها محدود مي‌شود. بر اساس شدت آگلوتيناسيون (1 تا 4) و يا محل اتصال اسپرم‌ها بهم  ‌مي‌توان طبقه‌بندي‌هاي زيررا ارائه نمود.

بر اساس شدت چسبندگي

: Grade 1(Isolated)  كمتر از 10 اسپرم در هر توده آگلوتينه وجود دارد و اكثر اسپرم‌ها آزادند

Grade 2 (Moderate): حدود 10 تا 15 اسپرم در هر توده آگلوتينه وجود داشته و اسپرم‌هاي آزاد نيز وجود دارند

Grade 3  (Large) :  بيش از 50 اسپرم در هر توده آگلوتينه وجود دارد اما هنوز هم تعداد كمي اسپرم آزاد ديده مي‌شود

Grade 4  (Gross):  تمام اسپرم‌ها بهم چسبيده‌اند و توده‌هاي آگلوتينه بهم متصلند.

 بر اساس محل چسبندگي

-         چسبندگي با سر

-          چسبندگي دم با دم. در اين حالت سرها آزاد بوده و حركت مي‌كنند.

-         چسبندگي نوك دم‌ها با يكديگر

-          چسبندگي سرها با هم و دم‌ها با همديگر

-         چسبندگي توده‌اي، كه سرها و دم‌ها در هم تنيده شده‌اند و ديگر بصورت مجزا ديده نمي‌شوند.

نكته 1:بهم چسبيدن اسپرم‌ها اگر چه مي‌تواند نشانه وجود آنتي‌بادي‌هاي ضد اسپرم باشد اما دليلي كافي براي ايمونولوژيك دانستن منشأ ناباروري نيست و نياز به مطالعات تكميلي دارد. 

نكته 2: آگلوتيناسيون شديد مي‌تواند در ارزيابي حركت و غلظت اسپرم تأثير گذارد. ساير اجزاء سلولي در مايع انزالي ممكن است سلول‌هاي غير از اسپرم وجود داشته باشند كه برخي از آنها داراي ارزش باليني هستند. اين سلول‌ها شامل سلول‌هاي اپي‌تليال دستگاه ادراري– تناسلي و سلول‌هاي گرد (گلبول‌هاي سفيد و سلول‌هاي زاياي نابالغ) مي‌باشند. با رنگ‌آميزي اسمير و بزرگنمايي 1000 مي‌توان اين سلول‌ها را شناسايي نمود. براي شناسايي دقيق‌تر اين سلول‌ها مي‌توان از رنگ‌آميزي پراكسيداز يا تعيين آنتي‌ژن CD45 آنها استفاده نمود.

 براي تعيين غلظت آنها مي‌توان مثل شمارش اسپرم با استفاده از لام نئوبار آنها را شمارش كرد و يا اينكه با استفاده از يك اسمير رنگ‌آميزي شده و تعيين نسبت درصد آنها و دانستن غلظت اسپرم، تعداد آنها را محاسبه نمود.

 حركت اسپرم

  هرچه تعداد اسپرم‌هاي متحرك بيشتر باشد احتمال بروز حاملگي افزايش مي‌يابد. روش‌هاي تعيين حركت اسپرم به كمك كامپيوتر(CASA)  ذكر شده است.تحرك اسپرم را بايد بلافاصله پس از سيال شدن مايع مني ارزيابي كرد. اين زمان ترجيحاً 30دقيقه پس از نمونه‌گيري است، اما در هرحال نبايد از يك ساعت تجاوز نمايد زيرا دهيدراتاسيون، تغييرات PH يا دما اثرات منفي بر تحرك اسپرم دارند. 

براي بررسي تحرك اسپرم ابتدا نمونه را بخوبي مخلوط نموده و قبل از اينكه اسپرم‌ها ته‌نشين شوند لام مستقيمي به عمق حدود 20 μm تهيه مي‌كنيم. حدود يك دقيقه صبر نموده تا نمونه در زير لام ساكن شود و سپس با بزرگنمايي 200X يا 400X آن را بررسي مي‌نماييم. براي تعيين درصد اسپرم‌هاي متحرك حدود 200 اسپرم را بايد ارزيابي نمود. با گرفتن يك لام مجدد از نمونه و تعيين دوباره اسپرم‌هاي متحرك مي‌توان از صحت نتايج اطلاع حاصل نمود.

نكته: آزمايش را مي‌توان در حرارت اتاق يا37 انجام داد. در صورتي كه بخواهيم آزمايش در 37 انجام شود بايد علاوه بر نمونه، لام و لامل را هم در 37 قرار داد.

 طبقه‌بندي حركت اسپرماتوزوئيدها

 الف- اسپرماتوزوئيدهايي كه حركت پيشرونده دارند(PR). اسپرم‌هايي كه در اين گروه قرار مي‌گيرند بطور فعالانه‌اي حركت مي‌كنند. اين حركت ممكن است در يك خط مستقيم و يا در يك مسير دايره‌اي بزرگ ‌باشد و سرعت حركت اهميتي ندارد.

ب- اسپرماتوزوئيدهايي كه حركت غيرپيشرونده دارند (NP). شامل تمام حالاتي است كه اسپرم‌ها حركت پيشرونده ندارند. مثلاً ممكن است در يك مسير دايره‌اي كوچك حركت نمايند يا اينكه فقط يك حركت فلاژلي جزئي داشته باشند، بطوري كه فقط سر يا دم آنها حركت نمايد.

ج- بيحركت  (IM)كه اسپرم‌ها فاقد هرگونه حركت مي‌باشند.

توجه:

1-  در چاپ قبلي اين كتاب اسپرم‌هايي كه حركت پيشرونده دارند به دو دسته سريع و كند تقسيم مي‌شدند و آنهايي كه سرعت حركت بيش از  25 µm/secجزء grade A طبقه‌بندي مي‌شدند، ‌اما اين نوع طبقه‌بندي براي تكنسين‌ها مشكل است

2- وقتي تحرك اسپرم گزارش مي‌شود بايد مشخص نماييم كه منظور حركت كل (PR+NP) است يا حركت پيشرونده (PR)

روش كار :براي بررسي تحرك اسپرم بهتر است از ميكروسكپ فاز كنتراست و بزرگنمايي 200 X يا 400  Xاستفاده نمود. از نمونه يك لام مستقيم به عمق 20µm تهيه نموده و صبر مي‌كنيم تا نمونه ساكن شود.ميدان‌هاي ديد مختلف را بصورت رندوم بررسي نموده و 200 اسپرم را ارزيابي مي‌كنيم. بهتر است اسپرم‌هايي را بررسي نماييم كه حداقل در فاصله 5 ميلي‌متري از لبه لام قرار دارند.

 اين كار باعث مي‌شود تا از اثر خشك شدن لام روي حركت اسپرم‌ها جلوگيري بعمل آيد. ارزيابي تحرك اسپرم‌ها بايد سريعاً انجام شود تا اسپرم‌هاي متحرك از ميدان ديد خارج نشده و يا وارد آن نگردند. بهترين كار استفاده از ميكروسكپي است كه لنز چشمي آن بصورت شطرنجي تقسيم ‌بندي شده باشد.اگر غلظت اسپرم زياد باشد فقط رديف بالاي چهارخانه شطرنجي را بررسي مي‌كنيم و در صورتي كه غلظت اسپرم كم باشد كل چهارخانه را مورد ارزيابي قرار مي‌دهيم تا 200 اسپرم بررسي گردند. ابتدا اسپرم‌هايي كه حركت پيشرونده دارند (PR) و سپس آنهايي كه حركت غيرپيشرونده دارند (NP) را شمارش نموده و در آخر اسپرم‌هاي بيحركت (IM) را مي‌شماريم.

 البته با تمرين و كسب تجربه مي‌توان هر سه را با هم شمارش كرد. براي شمارش اسپرم‌ها مي‌توان از كانتر استفاده نمود.براي بررسي صحت كار يك لام مجدد از نمونه تهيه كرده و اسپرم‌هاي PR، NP و IM را مجدداً شمارش مي‌نماييم (در 200 اسپرم).

درصد هر گروه از اسپرم‌ها را در هر بار شمارش محاسبه نموده و ميانگين درصد آنها و اختلاف بين دو شمارش را براي اسپرم‌هاي PR، NP و IM بدست مي‌آوريم، اگر اين اختلاف در حد قابل‌ قبول بود ميانگين درصدها را گزارش مي‌كنيم و اگر غير قابل ‌قبول بود دو لام ديگر تهيه كرده و مجدداً شمارش را انجام مي‌دهيم و به روش ذكرشده ارزيابي مي‌كنيم. 

تفاوت قابل قبول بين درصدها در دو بار شمارش 200تايي (مجموعاً 400 اسپرم شمارش شده‌اند)وقتي درصد اسپرم‌هاي PR، NP و IM را تعيين نموديم عدد حاصل را به نزديكترين عدد زوج گرد مي‌نماييم، مثلا ً 5/32% را به 32% و عدد 5/3% را به 4% گرد مي‌كنيم. سپس بيشترين ميانگين را با جدول (1-2) مقايسه مي‌نماييم.

به دو مثال زير توجه نماييد:

مثال 1 - در نتايج حاصل از دو بار شمارش اسپرم اعداد زير بدست آمده است:

تفاوت شمارش‌ها

ميانگين

شمارش دوم

شمارش اول

 

10%

40%

50%

30%

PR

10%

10%

15%

5%

NP

30%

50%

65%

35%

IM

همانطور كه مشاهده مي‌شود بيشترين درصد مربوط به اسپرم‌هاي IM است. با توجه به جدول 1-2 براي ميانگين 50% اختلاف شمارش تا 10% قابل‌قبول است و در اين اندازه‌گيري چون تفاوت بين دو بار شمارش 30% بوده لذا اين اندازه‌گيري قابل‌قبول نبوده و مجدداَ بايد انجام شود.

مثال 2-  در نتايج حاصل از دو بار شمارش اسپرم اعداد زير بدست آمده است:

تفاوت شمارش‌ها

ميانگين

شمارش دوم

شمارش اول

 

6%

63%

66%

60%

PR

3%

5/4%

6%

3%

NP

9%

5/32%

28%

37%

IM

 همانطور كه قبلا ذكر شد اعداد 5/4% و 5/32% را به‌ترتيب به 4% و 32% گرد مي‌كنيم.

 در اين اندازه‌گيري، بيشترين درصد مربوط به اسپرم‌هايPR  است.

براي ميانگين 63% اختلاف شمارش تا 10% موردقبول است، لذا اين اندازه‌گيري از صحت كافي برخوردار بوده و ميانگين نتايج برايNP  و PR و IMپس از گرد شدن اعداد ‌بعنوان جواب بيمار گزارش مي‌گردد

توجه:

1- در تعيين اسپرم‌هاي متحرك فقط اسپرم‌هاي سالم را در نظر بگيريد (يعني فقط اسپرم‌هايي كه سر و دم دارند شمارش مي‌شوند و اگر اسپرم متحرك بدون سرم مشاهده شد جزء شمارش محسوب نمي‌گردد.

2- وجود اختلاف بين شمارش‌ها نشان‌دهنده آن است كه عمل مخلوط كردن يا برداشتن نمونه به‌درستي انجام نشده و يا اسپرم‌ها بطور يكنواخت در سطح لام پخش نشده‌اند. در اين حالت شمارش ر ا مجدداً با دو لام ديگر تكرار مي‌كنيم. گاهي اوقات حتي در سومين شمارش نيز اختلاف حاصل قابل‌قبول نيست. در اين حالت ميانگين را حساب كرده و آن را در جواب بيمار خاطرنشان مي‌كنيم.

3- چون از لحاظ ذهني تمايل به شمارش اسپرم‌هاي متحرك بيشتر است، لذا بهتر است در لام دوم ترتيب شمارش را تغيير دهيم تا Bias ايجاد نشود يعني ابتداIM  و NP و سپسPR   را بشماريم. در صورتي‌كه يك منطقه را براي شمارش و تعيين درصد اسپرم‌هاي متحرك انتخاب مي‌كنيم و آنها را بطور مجزا مي‌شماريم (يعني ابتدا PR و سپس NP و IMبايد توجه كرد كه ممكن است در شمارش به عدد 200 برسيم اما هنوز يكي از اين سه مورد را نشمرده باشيم يا كامل شمارش نكرده باشيم، در اين صورت بايد شمارش را ادامه داد (بيش از 200) تا همه گروههاي PR و NP و IM كاملاً شمارش شوند.

مقادير مرجع كمترين حد مرجع براي حركت كلي اسپرم (PR+NP) برابر 40% و برايPR  به ‌تنهايي 32% مي‌باشد.  


1393/02/01 12:00:00 ق.ظ
فایلهای مربوط به مقاله
نماپ
سماپ
مقالات
تماس با ما
طراحی و توسعه توسط گروه متخصصین ماورانت
www.Mavaranet.com